lili Wang
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MERFISH - overview

背景

1998年出现的单分子荧光原位杂交（smFISH）技术可量化mRNA分子拷贝数和空间位置。smFISH技术利用短寡核苷酸探针靶向检测转录本，当多条寡核苷酸与同一转录本结合，产生足够强度的荧光信号后进行定量。但通过smFISH同时测量的RNA种类数量有限，为解决通量和多轮成像准确性问题，Prof. Xiaowei Zhuang团队研发了基于单分子成像的方法MERFISH，即Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization，通过设计能检测纠错的编码方案，在单细胞分辨率下对千种RNA成像。

技术原理

将选择好的基因制成编码探针，也就是把barcodes（Error-robust）分配给细胞的RNA，通过组合标签(combinatorial labeling)、纠错编码(error-robust barcoding)、顺序成像(sequencitial imaging)三个核心步骤，结合标识细胞位置的染色结果，在单细胞水平上鉴定数千种RNA的拷贝数和空间定位，实现空间转录组表达测量。 MERFIH

技术思路：如何基于smFISH，提升通量？

顺序成像

前期研究引入了mRNA编码。尽管smFISH后续被扩展到允许多种荧光染料同时对几种mRNA成像，通量依然受到限制。由于光谱可区分染料的数量远远小于细胞中活跃基因数量，无法完成每增加一种mRNA就增加一种染料以区分不同mRNAs。除了用不同颜色的组合以区分mRNA，使用杂交次序(hybridization rounds)的组合也能对不同mRNAs编码，即使用同一位置不同成像轮次的荧光信号编码mRNAs MERFIHSequencital

但顺序成像并非完美方案，主要面临以下问题：

  1. 随着测序rounds (N)的增加，标注(labing) 多种RNA需要长实验时间和大量荧光探针，合成花费高。
  2. 随着测序rounds (N)的增加，由于每轮杂交过程中检测信号的错误累积，导致检测效率下降和错误识别增加。

针对以上问题，MERFISH团队采用了以下两个方法：

大规模合成寡核苷酸探针（针对问题1）

MERFISH使用先前已开发出一种 Oligopaint 方法，用于从包含数万个定制序列的阵列衍生(array-derived)寡核苷酸池(oligo-pools)中生成大量寡核苷酸探针，以标记染色体 DNA 。

除了使用大量编码探针提高效率的同时，由于在初级杂交步骤中仅标记RNA一次，有效降低了探针合成成本。具体而言，与read-out序列杂交仅需15min，与细胞RNA杂交需要10h+。

组合标注&可纠错编码（针对问题2）

  1. 组合标注 组合标注：对每个RNA用~192个编码探针(encoding probe)标记。每个探针各自包括一个中央RNA靶向区域，两段侧翼是read-out序列。这些探针将RNA转换为特殊组合的read-out序列。特定RNA的编码探针包括4个N read-out特定序列组合，对应于该RNA应被读取到”1”的4轮杂交。N轮杂交之间，结合探针通过光漂白失活。

  2. Error-robust barcodes Error-robust编码：统计结果表明，calling 错误(1→0)的比率(per bit)为10%，而错误识别(misidentification，0→1)的错误比率为4%。组合标记允许可检测的RNA物种的数量随着成像轮数呈指数增长，但检测误差也呈指数级增长。MERFISH基于扩展的汉明距离(d=4，MHD4) 设计Barcodes，为每个RNA分配一个二进制码，并根据二进制码用readout序列组合对RNA编码。

在MHD4中，位数上为”1”bits的数目恒定为4，两个code words之间间隔d=4汉明距离。如果存在一位读数错误(1 bit)，可纠错将读数分配给最近的正确Barcode；如果存在两位读数错误(2 bits)，能够检测出错误而无法纠正。 MERFIHHMD4 MERFIHBarcode

应用

  1. Conservation and divergence of cortical cell organization in human and mouse revealed by MERFISH doi：*https://doi.org/0.1126/science.abm1741

概述：使用MERFISH实现了对100多种神经元和非神经元细胞群的原位识别，绘制了具有高空间分辨率的人类大脑颞上回（superior temporal gyrus，STG）和颞中回（middle temporal gyrus，MTG）细胞图谱，探讨了细胞空间组织模式在人类和小鼠之间的异同

  1. Comparative analysis of MERFISH spatial transcriptomics with bulk and single-cell RNA sequencing MERFISH空间转录组学与批量scRNA-seq的比较分析 doi：*https://doi.org/10.1101/2022.03.04.483068

概述：文章对小鼠肝脏和肾脏组织同时进行了MERFISH (307-gene pannel)和bulk RNA-seq，scRNA-seq分析，给出结论：相比于scRNA-seq，MERFISH提供了定量可比的方法测量具有完整空间信息的单细胞基因表达，且能够独立解析肝脏肾脏的细胞亚型与空间结构（不需要集成scRNA-seq分析信息）。

个人思考

Key points

Pros
  • MERFISH比bulk RNA-seq检测出更多转录本(10x – 1000x)；
  • MERFISH比scRNA-seq具有更高的灵敏度（scRNA-seq扭曲了免疫细胞计数，MERFISH可产生更准确的RNA统计数据）；
  • MERFISH能够单独有效分辨出不同细胞亚群(resolve between different subpopulations)，结果与scVI/scANVI自动注释结果对比，表明不需要其他RNA-seq信息补充
Cons
  • 影响信号质量最主要因素是细胞分割。MERFISH使用了DAPI+膜蛋白抗体的组合用以荧光识别细胞核、膜边界 (MERlin 图像分析)。只有少部分(30-50%)转录本被有效存留（分配给细胞），大量的细胞在前期处理就被过滤。
  • 对于少数转录本数量极高的细胞(即每个细胞超过1000个)，由于RNA分子过于拥挤，MERFISH图像中的smFISH点会过于密集，无法准确识别单个RNA转录本。 MERFIHErrorSeg 图. MERFISH分割错误与QC
Key notes
  • Limited probe panel of Marker genes。MERFISH需要探针设计，因此先验的scRNA-seq信息是必要的，用来评估MERFISH结果是否包括足够的信息量。
  • 尽管根据peer review文章中显示MERFISH已能分辨空间结构与细胞亚型信息，但是需要关注到其现有局限性：对于表达丰度高的基因，由于细胞荧光信号拥挤效应(molecular crowding effect)导致检测偏差；同时细胞分割引入的误差也值得注意。

Reference

  1. [MERFISH Spatial Profiling Technology Vizgen](https://vizgen.com/technology/)
  2. [Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells Science](https://www.science.org/doi/10.1126/science.aaa6090)
  3. [Conservation and divergence of cortical cell organization in human and mouse revealed by MERFISH Science](https://www.science.org/doi/10.1126/science.abm1741)

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